COMPARAISON DE DEUX METHODES DE CENTRIFUGATION DE SPERMATOZOÏDES UTILISABLES POUR L’INSEMINATION INTRA-UTERINE

Lionel Wildy Moungala¹, Opheelia Makoyo Komba², Bénédicte Ndeboko³, Pamphile Assoumou², Ulysse Minkobame², Jacques Albert Bang Ntamack², Jean François Meye².
1. Scientifique médicale Département de Gynécologie et Obstétrique, Université de Pretoria, Steve Biko Academic Hospital, Pretoria, Afrique du Sud.
2 Gynécologue-Obstétricienne. Département de Gynécologie et Obstétrique, Université des Sciences de la Santé,
Centre Hospitalier Universitaire Mère–Enfant Fondation Jeanne Ebori Libreville, Gabon
3. Biochimiste-Biologiste Moléculaire & Cellulaire, Département de Biologie Cellulaire & Moléculaire-Génétique, Université des Sciences de la Santé, Laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire Mère–Enfant Fondation Jeanne Ebori, Libreville, Gabon

Correspondance et tirés à part : Opheelia Makoyo Komba boite postale 19328 Libreville, mopheelia@yahoo.fr

BmoVol1950 21-68-72

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Résumé

Objectif : Il s’est agi de comparer deux techniques de centrifugation de spermatozoïdes: la centrifugation à une couche et la centrifugation à deux couches au sein d’une cohorte d’hommes gabonais.
Patients et méthodes : C’est une étude prospective comparative, réalisée au laboratoire de biologie de la reproduction de l’hôpital Steve BIKO de Pretoria, du 1er janvier 2015 au 31 décembre 2016. Le liquide séminal a été obtenu à partir des prélèvements réalisés chez 20 gabonais orientés en Afrique du sud pour une assistance médicale à la procréation. Chaque échantillon était divisé en deux portions de même volume, et traité en utilisant les deux méthodes.
Résultats : La moyenne d’âge des patients était de 39 ans. De manière intéressante, la centrifugation à une couche a permis d’obtenir un nombre de spermatozoïdes statistiquement supérieur (32,64 x106/ml) à celui obtenu à l’issue de la centrifugation à 2 couches (11,36 x106/ml) avec un p=0.001. Les spermatozoïdes obtenus après la centrifugation à deux couches démontrent une meilleure mobilité (83,36% contre 72,81%) (p=0.001). Aussi le nombre total de spermatozoïdes mobiles est statistiquement plus élevé à la fin de la centrifugation à une seule couche (6,2 x106/ml contre 2,71 x106/ml). La réalisation du GDD est trois fois plus coûteuse que celle de la GDC.
Conclusion : l’ensemble de nos résultats nous a permis de montrer que la centrifugation à une couche est non seulement efficace, en terme de paramètres séminaux : numération et comptage de spermatozoïdes mobiles ; mais également moins onéreuse. Cette technique est applicable dans les pays en voie de développement tel que le Gabon, dans le cadre de la mise en place de programme de traitement de l’infertilité du couple.

Mots clés : Gradient de densité-Centrifugation- liquide séminal-Spermatozoïdes.

Abstract

Objective: To compare two density gradient centrifugations used for sperm preparation: single layer centrifugation and double layer centrifugation among a cohort of Gabonese men.
Patients and methodology: A comparative prospective study performed at the reproductive biology laboratory located at Steve Biko Hospital, from the 1st January 2015 to the 31st December 2016. Semen samples were collected from 20 Gabonese citizen referred in South Africa for fertility assistance. Each sample was divided into two aliquots of the same volume and processed using the two methods.
Results: The average age of patients was 39 years. The single layer centrifugation yielded significantly higher sperm concentration (32.64 x106/ml) (P<0.005) than the double layer centrifugation (11.36×106/ml). Spermatozoa obtained after processing using the double layer centrifugation had a significant higher progressive motility (83.36%) (P<0.005) compared to the single layer (72.81×106/ml). The total motile count was significantly greater in semen processed using the single layer centrifugation (6.2×106/ml) (p<0.05) than the double layer centrifugation (2.71×106/ml). The single layer centrifugation leads to better results on sperm concentration and total motile count.
In addition, this method is less costly than the double layer centrifugation.
Conclusion: Therefore, the single layer centrifugation is more appropriate to be used for the establishment of a low-cost semen preparation method for insemination in developing countries like Gabon, where basic fertility assistance is still not accessible.

Keywords: Density gradient-Centrifugation-seminal fluid-Spermatozoa.

Introduction

La stérilité du couple affecte près de 80 millions de personne dans le monde [1],  principalement dans lespays en voie de développement, qui font face à des problèmes de ressources matérielles et financières [2]. Le traitement de l’infertilité est très couteux et peu accessible dans ces pays, car la prise en charge ne représente pas toujours une priorité gouvernementale [3], bien qu’elle soit une priorité sociale. Plusieurs approches visant à rendre
accessible le traitement de l’infertilité dans les pays en voie de développement ont déjà été publiées [4,5,6] ; et l’une d’elle consiste à réduire les coûts liés à la préparation du sperme. En effet, développer ces méthodes de préparation du sperme, initier celles qui visent à réduire le coût de l’analyse du liquide séminale, et encourager l’utilisation des cellules reproductrices mises en culture sont des possibilités qui pourraient rendre la procréation assistée plus accessible [7]. Aussi, dans le cadre de l’Insémination Intra-Utérine (IIU), différentes méthodes de préparation des spermatozoïdes ont été développées durant ces vingt dernières années [8]. Ainsi, trois méthodes sont recommandées par l’organisation mondiale de la santé (OMS): le simple lavage, la technique du “swim-up” et le gradient de densité. [9]. Le “swim -up” et le gradient de densité sont les méthodes les plus utilisées dans le monde en général et dans les pays africains en particulier où l’IIU est pratiquée [10,11]. Il est important de noter que le gradient de densité inclut deux méthodes différentes : le gradient de densité continue (GDC) et le gradient de densité discontinue (GDD). D’après la littérature, le GDC est le plus pratiqué à cause de son coût qui reste moins élevé et de la facilité de sa mise en oeuvre [12,13,14]. Le GDC et le GDD étant deux techniques couramment utilisées dans le cadre de la prise en charge de la stérilité du couple, il nous a semblé intéressant de réaliser une étude comparative.
Ainsi, l’objectif de ce travail était de comparer les résultats qualitatifs et quantitatifs de ces deux techniques à partir des échantillons de spermes obtenus chez des donneurs de sperme
gabonais.

Patients et méthodes

Il s’agit d’une étude prospective comparative; réalisée sur deux années du 1er janvier 2015 au 31 décembre 2016.
Ce travail a été réalisé au sein du Laboratoire de Biologie de la Reproduction de l’Hôpital Steve BIKO de Pretoria en Afrique du Sud. Les partenaires des femmes venues en consultation pour infertilité et dont le spermogramme était normal selon les recommandations de l’organisation mondiale de la santé (OMS) publiée et 2010 [8], c’est-à-dire un volume supérieur ou égal à 1,5 mL, une concentration en spermatozoïdes comprise entre 15 million/mL et 250 million/mL, une mobilité progressive supérieure ou égale à 40% et un pourcentage de spertozoïdes ayant une mrpholgie normales supérieure à 4%. Les partenaires azoospermiques, oligozoospermiques, tératozoospermiques, asthénozoospermiques ou polyzoospermiques n’ont pas été retenus dans ce travail. Les différents participants à cette étude ont donné leur consentement éclairé orale. Le recueil de spermatozoïdes s’est fait par masturbation et selon le
mode opératoire décrit par l’OMS [8]. Chaque échantillon de spermatozoïdes était divisé en deux portions de même volume, afin de pratiquer les deux méthodes de séparation de spermatozoïdes (GDC et GDD). Le GDC est une technique qui s’avoisine au GDD. La seule différence se situe au niveau du nombre de gradient de concentration. En effet, la technique de GDC consistait à déposer l’échantillon de spermatozoïdes sur une colonne de gradient essentiellement avant d’être soumis à une centrifugation, tandis que le GDD nécessite deux colonnes de gradient de différentes densités. La technique de séparation sur gradient de densité discontinue a été représentée sur la figure 1.

Une préparation des gradients de concentration qui était composée d’une solution du Puresperm ayant deux concentrations différentes : PureSperm® 80% (Nidacon, cat no: PS80-100) et de PureSperm® 40% (Nidacon, cat no: PS40-100) a éété utilisée. Le GDC était préparé en ajoutant 1 mL de l’échantillon séminal au-dessus de 2 mL de PureSperm®80%, tandis que le GDD consistait, dans un premier temps à ajouter 2 mL de PureSperm® 40% au-dessus de 2 mL de PureSperm® 80% et dans un deuxième temps d’additionner 1 mL d’échantillon séminal au-dessus des gradients. Les gradients préalablement préparés ont été centrifugés pendant 20 minutes à une gravité de 300g. La centrifugation sur gradient de densité est une technique qui permet de séparer des cellules en fonction de leur densité. Ainsi les spermatozoïdes ayant une meilleure mobilité seront retrouvés dans la partie inférieure du tube appelée : culot. A la fin de chaque technique de centrifugation, le culot est resuspendu dans 5 mL de solution Pure Sperm wash et lavés au cours d’une centrifugation de rinçage à 500 g pendant 10min. Ensuite, une analyse de la numération et de la mobilité des spermatozoides a été réalisée sur 300 μL de chacune de préparation obtenue. Afin de mieux caractériser le nombre de spermatozoïdes et leur mobilité, deux évaluations ont été faites : la première à l’aide d’un microscope intégré (CASA, computer-aided spermanalysis, medeaLab). La deuxième, à travers un examen manuel, en utilisant les chambres de comptage de type Makler® et Neubauer®. Cette dernière évaluation manuelle permettait également d’apprécier la morphologie des spermatozoïdes. Les paramètres étudiés étaient les caractéristiques sociodémographiques (l’âge, le statut matrimonial, la classe sociale, le statut professionnel et la responsabilité dans le couple), les paramètres séminaux obtenus à l’issue de chaque méthode et le coût de chacune des méthodes. Les données ont été recueillies sur une fiche individuelle d’enquête et analysées à partir du logiciel EXCEL. Toute identification des patients, telle que des données personnelles (nom et prénom…) ont été protégées. Les variables quantitatives ont été exprimées en moyennes et les variables qualitatives en pourcentages. Elles ont été comparées entres elles grâce au test statistique non paramétrique de Wilcoxon (test de Wilcoxon-Mann- Whitney). Les différences étaient significatives pour des valeurs de p < 0,05.

Résultats

Notre population d’étude a été de 20 patients gabonais ; ainsi 20 échantillons séminaux ont été obtenus et utilisés pour la présente étude.

Caractéristiques sociodémographiques
La moyenne d’âge était de 39 ans avec des extrêmes de 32 et 46 ans. Les patients vivant en concubinage représentaient 70 % de notre échantillonnage contre 30% des hommes mariés. Les hommes inclus dans notre étude appartenaient tous à une classe sociale aisée. Aussi, 92% de ces derniers exerçaient une profession formelle. Il s’agissait d’une infertilité d’origine féminine dans 80% des cas.

Etude comparative des paramètres séminaux issus des deux méthodes
Les moyennes des paramètres séminaux (numération, mobilité et comptage de sperma-tozoïdes mobiles (CSM)), obtenus après avoir traité le liquide séminal en utilisant les techniques de GDC et GDD, sont présentées sous forme de tableau (tableau I).

Tableau I: Paramètres séminaux obtenus après les méthodes de gradient de densité continue (GDC) et de gradient de densité discontinue (GDD)

D’après ce tableau, on note 32,6.106/mL de spermatozoïdes obtenus à l’issue de la technique GDC contre seulement 11,3.106/mL de spermatozoïdes avec la technique GDD. Aussi, les spermatozoïdes obtenus selon la méthode GDD, présentaient une meilleure mobilité soit 83,3%. D’après le tableau ci-dessus, la numération moyenne des spermatozoïdes était considérablement plus élevée (p<0,001) à l’issue de la technique GDC comparé à celle du GDD soit respectivement (32,64×106/ml ±6,35 et 11,36 x106/ml ±7,05) (tableau I). Cependant, les résultats de mobilité obtenus indiquent que la méthode GDD sélectionnait des spermatozoïdes ayant une mobilité progressive et fléchante largement supérieure (p<0,001) à ceux obtenus selon la méthode GDC, soit respectivement (79,52%±9,53 et 61,53% ± 8,76) (tableau I). De plus, la moyenne de comptage de spermatozoïdes mobiles après la méthode GDC a été substantiellement supérieure (p<0,001) à celle du GDD, soit respectivement (6,02 x106/mL ±14,43 et 2,71 x106/mlL±14,87). Afin de comparer les coûts des deux techniques, nous avons dressé un tableau qui indique le prix de chacune (tableau II). D’ après le tableau ci-dessus, nous notons que le coût de réalisation de la technique GDD est trois fois plus élevé que celui de la réalisation de la GDC.

Tableau II : valeur estimative de chaque technique

Discussion

Notre étude a été réalisée sur 20 sujets masculins. Aussi, nous notons que cette cohorte de faible densité en termes d’individu pourrait s’expliquer par le fait que le Gabon ne dispose pas à ce jour de laboratoire public pratiquant une aide médicale à la procréation. De plus, la plus part des couples concernés doivent s’organiser pour effectuer un voyage à l’étranger enfin d’en bénéficier.
Dans cette étude, nous avons comparé l’efficacité de deux techniques utilisées pour évaluer les paramètres séminaux du sperme recueilli chez des sujets masculins dont le couple est infertile. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps étudié les caractéristiques sociodémographiques de notre population d’étude. Nos résultats, montrent qu’elle était composée d’individus dont l’âge moyen était de 39 ans avec des extrêmes de 32 et 46 ans. Ces individus sont relativement jeunes. Mais cela n’est pas surprenant car il s’agit d’une tranche d’âge chez les hommes où le désir d’enfant est accru à cause de leur situation sociale et professionnelle relativement stable. Ce résultat est en accord avec celui obtenu par Brzakowski [15]. En termes de responsabilité dans le couple, nous avons retrouvé une origine féminine isolée dans 80% des cas et 20% de cause inexpliquée. Ce résultat pourrait s’expliquer par le profil des individus masculins inclus dans notre étude, qui présentent tous un spermogramme normal. En effet, ceci ne cadre pas avec les données de la littérature. Thonneau et al. en France retrouvaient respec-tivement une responsabilité féminine isolée dans 32% des cas, une responsabilité mixte dans 39% des cas, une responsabilité masculine isolée dans 20% des cas et une stérilité d’étiologie indéterminée dans 8% des cas [16]. La présente étude évaluait la différence en termes de numération, mobilité et comptage de spermatozoïdes mobiles issus de deux méthodes de centrifugation des
spermatozoïdes, utilisés généralement pendant l’insémination intra utérine ou encore durant la fécondation in-vitro. Ainsi lorsque nous les comparons, il en ressort que le nombre de spermatozoïdes obtenus est plus élevé à l’issue de la technique de GDC comparé à elle de GDD, soit respectivement 32,6 x106/mL et 11,4 x106/mL. Ce résultat n’est pas étonnant car l’utilisation de deux gradients à la fois par la méthode de GDD a conduit certainement à une perte de matériel et en l’occurrence des spermatozoïdes d’où ce nombre inférieur du nombre de spermatozoides obtenu à l’issue de cette technique. Un résultat similaire avait déjà été obtenu par l’équipe de Turhan et ses collègues, lesquels avaient conclu à une sélection des spermatozoïdes rapide et mobile après la technique GDD, et une numération de spermatozoïde largement supérieure résultant de la méthode GDC [14]. Toutefois, la méthode de GDD a permis de sélectionner des spermatozoïdes de meilleure mobilité (79,5% contre 61,5%). Ceci peut également s’expliquer par l’utilisation de la double densité. En effet, la centrifugation des spermatozoïdes sur un gradient à double densité permet naturellement de sélectionner des spermatozoïdes les plus efficaces en termes de mobilité [17]. En ce qui concerne le coût, nous trouvons également un intérêt à pratiquer la méthode GDC ; En effet une sélection des spermatozoïdes par centrifugation sur gradient continu est plus économique car elle ne nécessite qu’un seul gradient. Ce qui n’est pas le cas lors de la centrifugation sur gradient discontinu. En effet, la centrifugation sur gradient discontinue GDD nécessite deux solutions : PureSperm* 100 (100ml) et le PureSperm* Buffer ; qui coûtent respectivement 304 250 FCFA et 81 000 FCFA soit un total de 385 000 FCFA. Tandis que la centrifugation sur gradient continu ne nécessite qu’une solution le PureSperm Wash qui est estimée à 118 400 FCFA.
Bien que la présente étude révèle une sélection des spermatozoïdes quantitativement plus importante après la méthode GDC, il n’en demeure pas moins que la méthode GDD soit la plus utilisée globalement par les laboratoires de procréation assistée [18], il faut aussi noter que certaines recherches ont démontré un risque de contamination plus élevé en utilisant la méthode GDC [19].
D’autres centres d’assistance de procréation, associent la méthode GDD simultanément au ProInsert (Nidacon International). Le ProInsert est une innovation du laboratoire Nidacon International, qui consiste à centrifuger le liquide séminal à l’aide d’un tube qui permet de faciliter l’isolation du culot sans interaction avec la couche superficielle. Cette méthode a été prouvée comme étant performante dans l’élimination de toute contamination éventuelle (bactéries et certains virus) pendant la préparation des spermatozoïdes [20].

Conclusion

La méthode de centrifugation des spermatozoïdes sur gradient de densité continue est une technique de choix dans certains Laboratoires, la méthode GDC a démontré être la plus efficace en terme de numération, de CSM mais aussi en terme de coût et de temps. Ce moyen de préparation de spermatozoïdes peut être indiqué dans les pays en voie de développement dont la prise en charge deproblèmes de stérilité dans le couple est encore embryonnaire.

Remerciements

Cette recherche a été sponsorisée par le Comité de Recherche de la faculté de médecine de l’université de Pretoria (RESCOM) et le National Research Fund de l’Afrique du Sud (Numéro de projet: 54/2014).

Références